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摘自《中國沼氣》第6期 趙宇莎 鄭丹 于琪 茍敬 湯岳琴

沼氣工程沼氣池厭氧消化能有效地促進(jìn)能源與環(huán)境的協(xié)調(diào)發(fā)  展,一直備受關(guān)注。該過程通常需要不同微生物群  落(發(fā)酵細(xì)菌,產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌和產(chǎn)甲烷菌)的參與協(xié)  作,才能實(shí)現(xiàn)甲烷的生產(chǎn)。研究證實(shí),有更多功  能與特性未知的未培養(yǎng)微生物參與了沼氣工程沼氣池厭氧消化過  程,產(chǎn)甲烷機(jī)制比預(yù)期的更加復(fù)雜2。因此,鑒定  沼氣工程沼氣池厭氧消化體系中的微生物多樣性,有助于深入理解  產(chǎn)甲烷機(jī)制并指導(dǎo)工藝優(yōu)化調(diào)控。宏基因組學(xué)是近  20年新興的科學(xué)領(lǐng)域,它避開微生物的分離培養(yǎng)過

程,直接從基因?qū)用嬖谎芯课⑸锏亩鄻有?可最大限度地識(shí)別環(huán)境微生物的群落信息?；诤昊蚪M的分子生物學(xué)技術(shù)(如DGGE,16sRNA基因克隆文庫,T-RFLP等)的發(fā)展,已經(jīng)成為分析沼氣工程沼氣池厭氧消化過程優(yōu)勢(shì)微生物的重要平臺(tái)。但這些傳統(tǒng)方法鑒定到的優(yōu)勢(shì)菌群往往并非是“真正”的功能微生物。

DNA穩(wěn)定同位素探針( DNA stable- Isotope pro-bing,DNA-SP)是一種新興的分子生態(tài)學(xué)技術(shù),可

用于甄別復(fù)雜環(huán)境中參與特殊代謝功能的微生物。  其基本原理為:環(huán)境樣品經(jīng)穩(wěn)定同位素標(biāo)記的底物  (以C為主)培養(yǎng)后,微生物利用“C底物生長繁殖  合成"CDNA,通過浮力密度差異將”CDNA與”C  DNA分離,進(jìn)一步對(duì)CDNA進(jìn)行分析即可獲得功  能微生物的信息。由于 DNA-SIP僅以來源于底物  利用菌的CDNA為研究對(duì)象,因此極大地降低了  環(huán)境微生物群落的復(fù)雜性,從而將底物代謝過程與  微生物群落組成直接相聯(lián)系3。鑒于 DNA-SIH技  術(shù)的優(yōu)勢(shì),現(xiàn)已被應(yīng)用于不同環(huán)境中各類微生物功  能菌的鑒定(如甲基互營,生物降解,碳氮循環(huán)等過  程),但其在沼氣工程沼氣池厭氧消化過程中的應(yīng)用相對(duì)較少6  此外, DNA-SIP存在CDNA回收量小、時(shí)間

長、容易交叉標(biāo)記等缺陷,因此,探索合適的標(biāo)記及  離心條件并獲得足夠的CDNA是成功富集功能微

生物的關(guān)鍵。本研究以”C葡萄糖為底物,考察

了不同條件對(duì)沼氣工程沼氣池厭氧消化污泥中葡萄糖利用菌的標(biāo)記  效果旨在為鑒定真正的沼氣工程沼氣池厭氧消化功能群提供基礎(chǔ),

進(jìn)而促進(jìn)對(duì)沼氣工程沼氣池厭氧產(chǎn)甲烷機(jī)制的理解。

材料與方法

1.I污泥來源

用于穩(wěn)定同位素標(biāo)記的污泥來自本實(shí)驗(yàn)的纖維

素沼氣工程沼氣池厭氧消化反應(yīng)器。該完全混合型反應(yīng)器總體積3L

工作體積2L,纖維素進(jìn)料負(fù)荷為1gLd-1,在53℃

低速攪拌(85mm)條件下連續(xù)穩(wěn)定運(yùn)行212d。

1.2試劑

主要試劑如”C葡萄糖(C,99%),CsCl,CTAB購于 sIgma公司(美國)

1.3污泥樣品的標(biāo)記及分析

1.3.1標(biāo)記樣品的培養(yǎng)及采樣

取30mL沼氣工程沼氣池厭氧消化污泥于50mL沼氣工程沼氣池厭氧瓶中,通

氮?dú)庵脫Q空氣后,立即采用丁基膠塞和鋁蓋密封并放置于搖床中餓養(yǎng)至污泥停止產(chǎn)氣。隨后將葡萄糖溶于滅菌水后采用無菌注射器投入沼氣工程沼氣池厭氧瓶,同時(shí)補(bǔ)充少量微量元素溶液,于53℃和150mpm條件下培養(yǎng)并取樣分析。底物添加及取樣操作均在沼氣工程沼氣池厭氧手套箱( Gene Science AG30,美國)中進(jìn)行。所有處理均設(shè)置兩個(gè)平行樣,并分別以C葡萄糖作為對(duì)照。其中,使用的微量元素溶液組分如下(gL)FeCl3·6H2O,1.35;MnCl2·4H2O,0.1;CaC2·2H,0,0.1;ZnC2,0.1;CuO2H20,0.025;H3BO3,0  01;Na2MO4·2H20,0.024;NaCl,1.O;Na2SeO3·5

H2O,0.026;次氮基三乙酸(NTA),12.8  1.3.2標(biāo)記過程的氣體和樣品收集

定期采用10mL無菌注射器測(cè)定產(chǎn)氣量  品樣定期取樣后,于12000pm,4℃離心10min后

污泥沉淀和適量體積PBS緩沖溶液混合震蕩,于

12000m,4℃離心10min,反復(fù)清洗2-3次后,去除上清液,污泥沉淀保存于-80℃,用于后續(xù)的PCR1.3.3超高速密度梯度離心分離

利用常規(guī)CTAB法提取污泥的總DNA。取

Hg DNA,與4.8 mL CsCl溶液,1.2 mL Grader

er(GB緩沖液)混勻,采用10m無菌注射器將混合液移至6ml超高速離心管中,于超高速離心機(jī)( Beckman Coulter, OptimaI.80XP,美國)離心形成浮力密度梯度區(qū)帶。離心后使用軟管連接精密注射泵( Harvard Apparatus Pump Il Pico Plus,美國)與離心管,利用無菌水的水壓收集各層樣品,并采用折光儀( Reichert AR200,美國)測(cè)定各層級(jí)折光率。折光率與密度的換算公式如下:

n=0.07969+1.2649

式中:n為液體折光率;p為液體密度,gmL

1.3.4熒光定量PCR分析

對(duì)各層樣品的16 SrNA基因含量(拷貝數(shù))進(jìn)行熒光定量PCR分析。反應(yīng)體系總體積為20μl包括:10uM引物Eu518F及Eu27F各0.8ul,SYBR染液10山1,DNA2.0,滅菌水6.4ul。PCR反應(yīng)  條件如下:95℃,預(yù)變性308;95℃,變性10s,50℃退火5s,72℃,延伸40s,共40個(gè)循環(huán);融解95℃10s,65℃60s,97℃1s;冷卻37℃30s。以16sTDNA基因的豐度(每層拷貝數(shù)與各層級(jí)拷貝數(shù)總和的比值)為縱坐標(biāo),浮力密度為橫坐標(biāo),可得16mDNA基因在不同浮力密度中的分布規(guī)律圖。

1.4DNA-SP標(biāo)記條件的優(yōu)化

1.4.1離心轉(zhuǎn)速對(duì)DNA-SIP標(biāo)記效果的影響

取底物投加量為30mg葡萄糖,標(biāo)記時(shí)間為4天的樣品,分別在45400mpm和50300mm的轉(zhuǎn)速下于20℃離心40h,考察超高速離心轉(zhuǎn)速對(duì)標(biāo)記效果的影響

1.4.2底物投加量對(duì) DNA-SIP標(biāo)記效果的影響

分別投加總量為30mg和60mg的葡萄糖,考察底物投機(jī)量對(duì)標(biāo)記效果的影響。30mg葡萄糖次性投加,停止產(chǎn)氣時(shí)(4d)取樣。60mg葡萄糖于  第0和6天分別投加30mg,取樣時(shí)間為第11天

143若平消它每DP標(biāo)定效果的響

10mn。利用上清液稀釋使得污泥固含量分別為  a1%,0.2%,0.4%,2.1%(w/w)。分批投加總量  為100mg的葡萄糖進(jìn)行標(biāo)記培養(yǎng),即于第0,4和8  天分別投加333mg,取樣時(shí)間為第8和12天(取  樣時(shí)底物投加總量分別為660m和100mg)。樣  品經(jīng)20℃,45400m,40h超離速離心分層后,考察  污泥固含量對(duì)標(biāo)記效果的影響。

結(jié)果

離心條件優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)室前期小試發(fā)現(xiàn):經(jīng)C葡萄糖標(biāo)記的污泥中的CDNA與CDNA的浮力密度分別為1.70

及1.72-1.74gmL左右(數(shù)據(jù)未顯示)。因此,本研究考察了文獻(xiàn)報(bào)道常用的兩個(gè)離心轉(zhuǎn)速(50300mm和45400mpm)對(duì)污泥樣品的 DNA-SIP  標(biāo)記效果。表1顯示:不同轉(zhuǎn)速下形成的CC介質(zhì)  中相鄰梯度區(qū)帶的浮力密度差有較大差異。由表1  可知轉(zhuǎn)速為45400mpm形成的浮力密度差較小。為  確保兩種DNA離心后相隔一個(gè)區(qū)帶,能被有效分  離,故后續(xù)離心條件設(shè)為20℃,45400mpm,40h  表1不同轉(zhuǎn)速條件下微生物DNA的分離效果(gmL

2.2底物投加量優(yōu)化

分別向污泥中投加總量為30mg和60mg的葡萄糖,產(chǎn)氣量如圖1所示。由圖可知:所有樣品的產(chǎn)氣量均在第1天迅速升高,微生物每消耗完30mg葡萄糖大約需4~6d,隨后逐漸停止產(chǎn)氣。且C

葡萄糖與C葡萄糖的產(chǎn)氣趨勢(shì)及產(chǎn)氣量基本吻合,可作為對(duì)照進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。同時(shí),根據(jù)產(chǎn)氣結(jié)果,將30mg和60mg葡萄糖標(biāo)記樣品的取樣時(shí)間分別設(shè)置為第4天和第11天。

標(biāo)記后的污泥樣品經(jīng)超高速離心分層以后,利  用定量PCR檢測(cè)每層的16 S rDNA基因含量。獲得  16 S rDNA基因豐度在不同浮力密度中的分布規(guī)律,  如圖3和圖4所示。由圖可知,在輕密度層1.69~  1.71gmL的范圍內(nèi),所有樣品均出現(xiàn)最高豐度,  這表明污泥樣品CDNA在1.70gm-左右的密度  層被富集。在重密度層1.72~1.74gmL的范圍  內(nèi),投加有30mgC-葡萄糖的污泥樣品僅檢測(cè)到  較低的16 S rdNA基因拷貝數(shù),表明該條件下C  DNA富集程度不高。投加有60mg"C-葡萄糖的樣  品CDNA豐度明顯提高,兩個(gè)平行樣品的豐度分  別達(dá)到了10.41%和6.05%,而C葡萄糖對(duì)照樣品  中的豐度僅為1.0%,這表明60mg的C-葡萄糖可  以富集到更多的CDNA,功能菌能被有效標(biāo)記。  但圖3和圖4也顯示,在1.72~1.74g·mL前后的  密度層中也能檢測(cè)到一定數(shù)量的CDNA。因此,為了  為提高重密度層中CDNA的豐度,減少非目標(biāo)微生

2.3污泥固含量優(yōu)化

污泥固含量對(duì) DNA-SIP標(biāo)記效果的影響如圖5~  圖8所示。由圖可知:在1.72-1.74gmL的密度范  圍內(nèi),污泥固含量為0.1%,0.2%和0.4%(w/w)的所  有樣品的CDNA拷貝數(shù)明顯高于2.1%的樣品。  當(dāng)?shù)孜锿都恿繛?6.6mg時(shí)(標(biāo)記8天的樣  品),C-DNA主要存在于1.72gmL左右的密度層,且不同污泥固含量樣品的"CDNA豐度差異較大。污泥固含量為0.1%,0.2%,0.4%和2.1%(w/w)的樣品中,C-DNA豐度分別約為16.3%10%,10%和8.2%。這表示在該底物濃度下污泥固含量越低,C-DNA富集程度越高。而在更“重”的密度層1.74g·mL附近,各污泥固含量的CDNA豐度均低于5%。

當(dāng)?shù)孜锿都恿繛?00mg時(shí)(標(biāo)記12d的樣品),與第8天的標(biāo)記樣品相比,所有污泥樣品在72-1.74g·mL密度層的CDNA豐度均有明顯提升。尤其在1.74g·mL的密度層,除污泥固含量為2.1%的樣品外,其它樣品的CDNA豐度均從第8天的低于5%提升至15%左右。上述結(jié)果

表明:當(dāng)?shù)孜锿都恿繌?6.6mg增至100mg時(shí),可  有效提高CDNA在重密度層的豐度,顯示出更好  的標(biāo)記效果。此外2.1%固含量的污泥樣品中的CDNA拷貝數(shù)在1.72-1.74gmL密度層仍然最低,表明即使投加更高濃度的底物,相對(duì)較低的污泥固含量仍更有利于CDNA的富集。但在污泥固含量為0.4%,0.2%,0.1%的樣品中,CDNA在1.74gmL密度層的豐度并未隨著污泥固含量的減少而增大(分別為16.3%,14.2%和14%)。這可能是底物投加量已超過污泥中微生物的代謝水

平,大部分功能微生物已被標(biāo)記,若繼續(xù)增加底物投  加量難以提高樣品的標(biāo)記效果。

討論

DNA-SIH具有鑒定不同環(huán)境中“真正”功能微  物的優(yōu)勢(shì)。合適的標(biāo)記及離心條件可以避免底物  二級(jí)利用,確保DNA的標(biāo)記及富集效果,是決定  該技術(shù)成功的關(guān)鍵。但標(biāo)記效果受到多因素的影  響:如環(huán)境樣品性質(zhì)、微生物種類、底物結(jié)構(gòu)、標(biāo)記時(shí)  間離心轉(zhuǎn)速及時(shí)間等, DNA-SIP的培養(yǎng)條件及離心  條件難以標(biāo)準(zhǔn)化。鑒于利用 DNA-SIP識(shí)別沼氣工程沼氣池厭氧  消化功能微生物的研究相對(duì)較少,本研究考察了不  同條件(離心轉(zhuǎn)速、底物投加量和污泥固含量)對(duì)厭  氧污泥中葡萄糖利用菌的標(biāo)記效果的影響。  利用超高速密度梯度離心技術(shù)可有效地將環(huán)境  總DNA中的CDNA與CDNA有效分離。本研  究發(fā)現(xiàn)45400mm的轉(zhuǎn)速比50300mpm有更好的CDNA富集效果。據(jù)報(bào)道,DNA在CaC1介質(zhì)中的浮力密度與微生物的GC含量成正比”。但無論哪種轉(zhuǎn)速條件,重浮力密度層仍然同時(shí)含有2CDNA與CDNA。 Lueders8等發(fā)現(xiàn),即使采用純菌的CDNA進(jìn)行超高速離心,重密度層中仍能檢測(cè)到0.7%的CDNA。因此,這說明目標(biāo)微生物很難00%被標(biāo)記, DNA-SIF實(shí)驗(yàn)必須設(shè)計(jì)C底物的對(duì)照樣品。

研究表明,當(dāng) C-DNA豐度接近20%時(shí),更容  易從環(huán)境樣品總DNA中分離出"CDNA。而C  DNA的生成伴隨著微生物細(xì)胞對(duì)底物的同化利用,  這表明CDNA豐度與底物投加量和微生物種群數(shù)  量(本文為污泥固含量)存在直接聯(lián)系。底物投加  量優(yōu)化結(jié)果顯示:在1.2-1.74g·mL-的密度范

圍內(nèi),投加30mg1C-葡萄糖的污泥樣品的C.DNA

豐度較低。目前尚無標(biāo)準(zhǔn)方法來確定底物投加量

但底物濃度過低難以標(biāo)記到目標(biāo)微生物,因?yàn)閮H有

1/3的底物被微生物用于合成自身物質(zhì)。此外,加入體系的底物被微生物同化之前會(huì)有一個(gè)稀釋過

程,這使得微生物會(huì)暫時(shí)利用其他碳源或中間代謝產(chǎn)物,這一特性降低了C-DNA的比例,進(jìn)一步增加了計(jì)算底物投加量的難度°。雖然分批投加60mgC-葡萄糖可以將C-DNA豐度提高到10.41%,但仍含有較多的非目標(biāo)微生物。因此,在后續(xù)考察污泥固含量的研究中,將"C-葡萄糖投加量提高到了100mg,此時(shí)污泥中C-DNA豐度最高可達(dá)16.3%。上述結(jié)果表明,高的底物投加量有助于提高CDNA豐度。但底物投加量過高,一方面會(huì)增加DNA-SIP的成本;另一方面會(huì)使樣品脫離原始狀態(tài)群落代謝過程受到影響,產(chǎn)生微生物富集偏差,不符合 DNA-SIP原位鑒定的宗旨。因此,在滿足CDNA的標(biāo)記效果及分離效果的基礎(chǔ)上,采用最少的C底物是理想的培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。污泥固含量研究結(jié)果顯示:當(dāng)?shù)孜餄舛纫欢〞r(shí)(不高于污泥最高代謝水平),污泥固含量越低,C-DNA富集程度越高。該結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)底物量與微生物種群數(shù)量需要有合適的比例,才能獲得最高的標(biāo)記CDNA。不同研究報(bào)道中的微生物菌群生態(tài)位、生理代謝差異極大,因此,非常有必要對(duì)這兩個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化

4結(jié)論

選擇合適的標(biāo)記及離心條件以獲得足夠的C  DNA,是利用 DNA-SIR技術(shù)成功富集功能微生物的關(guān)鍵。本研究以C葡萄糖為底物,選取離心轉(zhuǎn)速,底物投加量和污泥固含量3個(gè)重要因素,考察了它  們對(duì)沼氣工程沼氣池厭氧消化污泥中葡萄糖利用菌的 DNA-SIP標(biāo)記效果的影響。結(jié)果顯示,相對(duì)低的轉(zhuǎn)速、高底物投  加量及低污泥固含量可以獲得較高的CDNA豐  度。但底物量不能一味增加,需同時(shí)考慮微生物的  代謝水平、與環(huán)境條件的一致性等因素,在盡量減少